Analysemetoder

cDNA analyse

cDNA analyse foretages for at identificere RNA splejsningsfejl som følge af mutationer på DNA niveau. Udgangsmaterialet er RNA. Der laves cDNA typisk med random-primere, andenstreng syntetiseres og derefter foretages PCR med genspecifikke primere. Produktet analyseres med gel elektroforese og/eller sekventering.

Celledyrkning

Der udføres to former for celledyrkning:

• Korttidsdyrkning af blod (leukocytter)
• Langtidsdyrkning til alle andre materialetyper (fibroblastkultur)

Korttidsdyrkning anvendes til kromosomanalyse og FISH.

Langtidsdyrkning kan anvendes til en lang række analyser, blandt andet kromosomanalyse, FISH, DNA-baserede analyser, RNA-baserede analyser og metaboliske analyser. Fibroblaster kan nedfryses til evt. senere brug.

Der findes ingen detektionsgrænse for selve celledyrkning. Der vurderes ud fra to parametre:

• Cellerne gror
• Ingen vækst - celledyrkningen mislykket

Korttidsdyrkning: Kvalitet af celledyrkning vurderes visuelt på metafasepræparater.

Langtidsdyrkning: Cellernes vurderes visuelt løbende under vækst. Risiko for maternel kontaminering ved føtale prøver vurderes visuelt under dyrkning.

FISH, Fluorescerende In Situ Hybridisering

FISH er en analysemetode, der anvender fluorescerende prober, som binder til specifikke steder på kromosomer. Der anvendes afhængig af problemstillingen enten standard FISH prober eller custom FISH prober fra kommercielle certificerede firmaer. Aktuelt bruges producenterne Cytocell, Vysis, Metasystems, Kreatech og Empire Genomic. Der findes forskellige typer af prober:

• Whole chromosome paint probe, WCP: farver et givet kromosompar i én farve
• Arm paint prober: farver den korte arm (p) henholdsvis den lange arm (q) i et kromosompar med hver sin farve
• Locus specifikke prober, LSI: probe der binder til et bestemt locus
• Centromerprobe, CEP: farver centromeret for et givet kromosom
• M-band: farvning af et enkelt kromosompar med forskellige farver
• M-FISH, Multicolour FISH: hvert kromosompar er farvet med en unik farve

FISH-analysen er en målrettet analyse, der belyser specifikke problemstillinger, og anvendes primært som supplement til andre metoder til belysning af strukturelle forhold eller undersøgelse for antalsfejl, herunder mosaikker. Metoden har en begrænset opløselighed. Der kan detekteres binding af prober med en størrelse ned til 80-100 Kb. Kvaliteten sikres ved godkendelse af de enkelte prober i opsætningen samt brug af målrettede kontroller for den enkelte analyse.

Fragmentanalyse

Ved fragmentanalyse undersøges den genetiske variation af repetitive sekvenser i udvalgte områder af genomisk DNA.

Metode bruges blandt andet ved analyse for Fragilt X syndrom samt til undersøgelse for uniparental disomi (og ved QF-PCR - se andetsteds). Metoden bruger PCR til at opformere genomisk DNA omkring og over de specifikke repetitive sekvenser, og kapillær elektroforese til at bestemme størrelsen/længden af de repetitive sekvenser.

For Fragilt X syndrom undersøges for repeatekspansion i et kendt CGG-repeat i FMR1 genet med Asuragen AmplideX FMR1 kit. Længden af CGG-repeatet afgør patogeniteten.

For uniparental disomi undersøges nedarvningsmønsteret af udvalgte repetitive sekvenser på enten kromosom 7, 14 eller 15 hos proband og forældre, for at klarlægge om probanden har arvet en allel fra hver forældre.

Genomsekventering

Genomsekventering foretages med Next Generation Sequencing teknologi (Illumina NovaSeq 6000, Illumina® DNA PCR-Free Genome Prep). Metoden er i stand til at detektere sekvensvarianter og copy number varianter (CNVer).
Data processeres med Illumina DRAGEN Bio-IT Platform. De kodende dele af patientens genom sammenholdes hvor muligt med data fra relevante familiemedlemmer. Der søges efter varianter, der følger de mistænkte nedarvningsmønstre. Derudover undersøges for kendte sygdomsfremkaldende varianter i ClinVar databasen.

I analysen vil langt størstedelen af de kodende områder være dækket (>95 % af de kodende områder er dækket >20X). Der vil dog altid være områder med utilstrækkeligt dækning, hvorfor varianter i disse områder ikke vil blive detekteret. Hele genomet undersøges for større CNVer (>50 kb) såfremt der ikke er foretaget kromosom mikroarray. Derudover er gener, der er knyttet til kendt monogen sygdom analyseret for mindre CNVer (>1-2 kb).

Metoden egner sig ikke til andre typer af varianter som tandem repeat-variationer samt strukturelle balancerede forandringer. Der er endvidere gener og områder, som ikke kan analyseres (f.eks. multimappede områder).

Den nuværende viden om genetiske varianter med betydning for abnorm fænotype er fortsat begrænset. Endvidere er der fortsat visse tekniske begrænsninger. Et normalt resultat udelukker derfor ikke helt tilstedeværelse af varianter med klinisk betydning. Ved dataanalysen søges udelukkende efter varianter, der er relaterede til den aktuelle problemstilling.

Eventuelle tilfældighedsfund vil blive rapporteret i henhold til patientens samtykke.

Genomsekventering, NGC

Genomsekventering er udført hos National Genomcenter (NGC) med NGS teknologi (Illumina NovaSeq 6000, Illumina® DNA PCR-Free Genome Prep). Data er præ-processeret af NGC med NBA2 germline pipeline.

Efterfølgende resultatbehandling, klinisk variantfortolkning samt svarafgivelse er udført af Klinisk Genetisk Afdeling, OUH.

Metoden er i stand til at detektere sekvensvarianter og copy number varianter (CNVer).

Patientens genom sammenholdes hvor muligt med data fra relevante familiemedlemmer. Der søges efter varianter der følger de mistænkte nedarvningsmønstre. Derudover undersøges for kendte sygdomsfremkaldende varianter i ClinVar databasen. I analysen vil langt størstedelen af de kodende områder være sekventeret tilstrækkeligt. Der vil dog altid være områder med utilstrækkeligt dækning, hvorfor varianter i disse områder ikke vil blive detekteret. Hele genomet undersøges for større CNVer (>50 kb). Derudover er gener der er knyttet til kendt monogen sygdom analyseret for mindre CNVer (>1-2 kb).

Metoden egner sig ikke til andre typer af varianter som tandem repeat-variationer samt strukturelle balancerede forandringer.

Den nuværende viden om genetiske varianter med betydning for abnorm fænotype er fortsat begrænset. Endvidere er der fortsat visse tekniske begrænsninger. Et normalt resultat udelukker derfor ikke helt tilstedeværelse af varianter med klinisk betydning. Ved dataanalysen søges udelukkende efter varianter, der er relaterede til den aktuelle problemstilling.

Eventuelle sekundære fund/tilfældighedsfund vil blive rapporteret i henhold til patientens samtykke.

Kromosomanalyse

Standardkromosomanalyse udføres efter G-båndsfarvning og digital billedoptagelse af metafaser. Der undersøges som standard 12 metafaser, hvori antallet af kromosomer tælles i alle, mens 5 metafaser karyotyperes.

Metoden har en begrænset opløselighed. Opløseligheden opgives i total antal bånd (TNB), der er synlige i den enkelte metafase. (Der henvises til ISCN, International standard for nomenclature of chromosome bands). Detektionsgrænsen på kromosomanalyser er ca. 400 bånd svarende til 5-10 Mb. Ved god kvalitet kan ses ned til 3 Mb. Forandringer mindre end dette kan ikke detekteres med metoden.

Ved kromosomanalysen skal et vist antal bånd være synlige, før resultatet kan godkendes svarende til en båndkvalitet på minimum 400 bånd. Båndtælling foretages efter Vancouver metoden på kromosom X, 10 og 12, som er en reduceret model, der er valideret samt Kiel metoden på kromosom 5, 7, 18.

Kromosom mikroarray

Kromosom mikroarray er en metode, der undersøger hele genomet for:

• Kvantitative kromosomale ændringer, deletioner og duplikationer af en vis størrelse. Således benyttes metoden også til kendte mikrodeletions- og mikroduplikationssyndromer, som tidligere blev påvist med andre metoder.
• Tab af heterozygositet (”loss of heterozygosity, LOH” eller ”region of homozygosity, ROH”) som er relevant ved konsanguinitet og uniparental disomi.
• Mosaikker af kvantitative ændringer over 20-30 %.

Der anvendes Thermo Fischer CytoScan HD til de fleste postnatale prøver og Thermo Fischer CytoScan 750K til prænatale prøver og de fleste forældreprøver.

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification assay, MLPA er udviklet af det hollandske firma MRC-Holland. Metoden bruges til detektion af deletioner og dublikationer. MLPA har en større opløselighed end f.eks. kromosom mikroarray, dvs. man kan detektere deletioner/duplikationer, som er mindre med MLPA.

Metoden bygger på kvantitativ ligering af på hinanden tætliggende DNA-prober, når disse er hybridiseret til target DNA som f.eks. et exon i et gen, der ønskes undersøgt. Proberne indeholder en sekvens komplementær til universale primere, der efterfølgende bruges til opformering af ligerede fragmenter ved PCR reaktion. Reaktionerne køres multiplex med op til 40 fragmenter i en reaktion.

Ved kvantitering af toppe i efterfølgende kapillar elektroforese diagram fås relative intensiteter, hvor der kan sammenlignes mellem prøver eller med normale prøver efter normalisering af signalerne. Til dette formål bruges GeneMarker software fra Softgenetics.

MS-MLPA: Ved visse MLPA protokoller skæres med et methyleringsfølsomt enzym efter hybridisering, ligering og PCR. Herved kan man differentiere, om allelerne er methyleret som udtryk for imprinting status (aktivt/inaktivt) for det targeterede område. Ved metoden kan man belyse, om der er uniparental disomi eller imprinting defekt i området. Anvendes ved analyserne Prader-Willi syndrom, Angelmann syndrom, Kagami-Ogata syndrom og Temple syndrom. Desuden undersøges for 6q24 methyleringsstatus ved enkelte paneler.

NGS, Next Generation Sequencing

Exomsekventeringsmetoden anvendes til screening af genpaneler og enkeltgener.

Ved sekventering undersøges den præcise baserækkefølge efter amplification af et DNA-fragment. Med Next Generation Sequencing (NGS) gøres dette samtidigt på et stort antal forskellige DNA fragmenter fra patientprøven.

Dette gøres ved først at ligere universal adaptorer til fragmenterne. Der foretages exom enrichment med en hybridiseringsbaseret metode, Twist. Derefter udføres paired-end sekventering med 2x150b (paired end sequencing) ved brug af Illumina NovaSeq. Sekventeringsdybden angiver det antal sekvenser, der dækker en given position. Hver base i de kodende exons og mindst 20 baser i de tilstødende regioner bliver sekventeret med en dybde på mindst 30 gange (30X).

Dataanalyse foretages med Illumina DRAGEN Bio-IT Platform og VarSeq software. Der foretages copy number analyse primært ved brug af Dragen, samt efter behov VarSeq og evt. MLPA.

NIPT

Der benyttes helgenomsekventering (WGS) som screeningsmetode for aneuploidier baseret på cell-free DNA (cfDNA) ekstraheret fra en blodprøve fra den gravide. Teknologien er baseret på tynd helgenomssekventering af cfDNA fra det maternelle blod ved Next Generation Sequencing (NGS) (Illumina NovaSeq 6000; ThruPLEX Plasma-seq). Data analyseres med Wisecondor software, og den føtale fraktion bestemmes med SeqFF software.

Forbehold: Testen anbefales ikke, hvis den gravide har modtaget en af følgende behandlinger inden for de sidste 3 måneder: blodtransfusion, immunterapi, stamcelleterapi, transplantation eller strålebehandling. Ved BMI over 35 er der større risiko for inkonklusivt resultat ved NIPT analysen. Placenta mosaicisme, føtal chimerisme, partiel føtal kromosom-aneuploidi af kromosomerne 13, 18 og 21 og vanishing twin kan give falsk positivt/falsk negativt screenings resultat. NIPT testen kan i sjældne tilfælde afsløre evt. større kromosomforandringer hos den gravide selv. Dette skyldes, at man med testen analyserer både fosterets og moderens DNA, der findes i den gravides plasma. For at opnå et sikkert analyseresultat skal den fosterrepræsentative DNA fraktion udgøre mindst 2.5% af den samlede mængde DNA i plasmaprøven (føtalfraktion).

QF-PCR

Kvantitativ fluorescens polymerase kæde reaktion, QF-PCR er en fragmentanalyse, som udnytter den genetiske variation af repetitive sekvenser i genomisk DNA. Analysen udføres med Devyser Compact Kit, som har prober for kromosomerne 13, 18, 21, X og Y. Ved behov anvendes Devyser Resolution kit.

Metoden anvendes til:

• aneuploidiscreening for kromosomerne 13,18,21,X og Y
• markørsammenligning ved
  • mistanke om maternel kontaminering (graviditetsprodukt sammenlignes med den gravides blodprøve)
  • mistanke om mola (graviditetsprodukt sammenlignes med blodprøve fra den gravide og barnefar)

Sanger sekventering

Ved sanger sekventering undersøges den præcise baserækkefølge efter amplification af et DNA-fragment. Ved hjælp af cyclesequencing indbygges 4 nukleotider mærket med forskellige fluorescerende stoffer i DNA fragmentet.

Ved kørsel gennem en kapillær DNA sekvenator fra Applied Biosystems, separeres DNA-fragmenterne efter størrelse. Under gennemkørslen i kapillarerne passerer DNA-fragmenterne en laser, der exiterer de flourescensmærkede fragmenter. Ved exitationen afgives lys med specifikke bølgelængder for hver af de 4 nucleotider. En detektor opfanger det afgivne lys, hvorved nucleotidpositioner i det sekventerede materiale detekteres.

Ved inspektionen af disse positioner for nucleotiderne sammenlignes med referencesekvens på de forskellige fragmenter og derved findes evt. afvigelser fra en referencesekvens.